Las redes multicapa de similitud genética de plásmidos revelan vías potenciales de transmisión de genes

The ISME Journal volumen 17, páginas 649–659 (2023)Cite este artículo

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La resistencia a los antimicrobianos (RAM) es una amenaza importante para la salud pública. Los plásmidos son vectores principales de genes AMR y contribuyen significativamente a su propagación y movilidad entre los huéspedes. Sin embargo, se sabe poco sobre la dinámica del intercambio genético de plásmidos entre huéspedes animales. Aquí, utilizamos la teoría y la metodología de la ecología de redes y enfermedades para investigar el potencial de transmisión genética entre plásmidos utilizando un conjunto de datos de 21 plasmidomas de una sola población de vacas lecheras. Construimos una red multicapa basada en la similitud genética de plásmidos por pares. La similitud genética es una firma de intercambio genético pasado que puede ayudar a identificar rutas y mecanismos potenciales de transmisión genética dentro y entre las vacas. Los vínculos entre vacas dominaron la red de transmisión y los plásmidos que contenían genes de movilidad estaban más conectados. El análisis de modularidad reveló un grupo de redes donde todos los plásmidos contenían un gen mobM y uno donde todos los plásmidos contenían un gen de beta-lactamasa. Las vacas que contienen ambos grupos también comparten vías de transmisión con muchas otras vacas, lo que las convierte en candidatas a la superpropagación. En apoyo de ello, encontramos firmas de superpropagación genética en las que unos pocos plásmidos y vacas son responsables de la mayor parte del intercambio genético. Un modelo de transmisión basado en agentes demostró que un nuevo gen que invada la población de vacas probablemente llegue a todas las vacas. Finalmente, demostramos que los pesos de los bordes contienen una firma no aleatoria para los mecanismos de transmisión genética, lo que nos permite diferenciar entre dispersión e intercambio genético. Estos resultados proporcionan información sobre cómo los genes, incluidos los que proporcionan RAM, se propagan entre los huéspedes animales.

La resistencia a los antimicrobianos (RAM) es una amenaza importante para la salud humana y animal a nivel mundial [1]. El ganado puede servir como reservorio de bacterias resistentes a los antibióticos debido al uso generalizado de antibióticos en el sector agrícola para la profilaxis y promoción del crecimiento [2, 3]. Es probable que esta tendencia continúe debido a la creciente demanda de productos animales y la intensificación de la producción ganadera a nivel mundial [4]. La RAM del ganado puede propagarse al medio ambiente, incluidos suelos y cuerpos de agua [5,6,7,8] y contaminar los productos alimenticios, llegando a los humanos [9].

La propagación de genes de resistencia a los antibióticos dentro y entre especies se produce principalmente a través de plásmidos [10]. Los plásmidos son elementos genéticos móviles, a menudo circulares y con una longitud de miles a cientos de miles de pares de bases, que pueden propagarse independientemente del cromosoma de su huésped. Si bien se pueden encontrar en arqueas y eucariotas, son más conocidos en bacterias [11]. Los plásmidos permiten que las bacterias se adapten a su entorno al transportar genes accesorios, como los de resistencia a antibióticos [12,13,14] o metales pesados ​​[14, 15], que son beneficiosos en condiciones ambientales particulares. Dada la importancia de los plásmidos para la propagación de la RAM [16, 17], es esencial comprender cómo se dispersan en sus hábitats naturales entre sus huéspedes animales e interactúan entre sí. Si bien los plásmidos son uno de los principales vehículos para la transferencia horizontal de genes (THG) entre bacterias, el intercambio genético también ocurre entre plásmidos, por ejemplo, mediante recombinación homóloga [11, 18]. Esto da como resultado la transferencia de genes entre plásmidos, que denominamos plásmido-HGT (pHGT). Debido al pHGT, muchos plásmidos parecen ser mosaicos. Los plásmidos mosaicos pueden incorporar material genético de múltiples plásmidos alojados en especies bacterianas lejanamente relacionadas, aunque esto varía significativamente según la taxonomía del huésped [19,20,21].

El ganado puede ser reservorio de plásmidos que contienen genes AMR [22,23,24,25]. De manera más general, los rumiantes, como el ganado vacuno, albergan diversas comunidades microbianas, particularmente en el rumen. Los microbios del rumen permiten que el ganado digiera materia vegetal que de otro modo no sería digerible [26, 27]. Si bien la investigación sobre plásmidos tradicionalmente se centró en aquellos que son clínicamente relevantes [28], los avances en metagenómica y tecnología de secuenciación han permitido la exploración del plasmidoma, todos los plásmidos dentro de un entorno de muestra determinado, incluido el rumen bovino [29, 30]. Este enfoque ha revelado que el plasmidoma del rumen bovino es diverso y difiere más entre individuos en comparación con el microbioma bacteriano [29, 30]. Basado en la similitud de sus marcos de lectura abiertos (ORF) con los de las bacterias, los plásmidos del rumen bovino aparecieron más comúnmente asociados con Firmicutes y Bacteroidetes [29, 30]. Muchos son mosaicos, incluidos algunos que muestran evidencia de intercambio genético entre filos [30]. Los plásmidos ruminales están enriquecidos para funciones relacionadas con la digestión y el metabolismo, así como para funciones de los plásmidos como la movilización y la replicación, pero la mayoría de los ORF tienen funciones desconocidas [29, 30]. También se informaron hallazgos similares en otros ecosistemas, como el ciego de rata, donde también se ha encontrado que los plásmidos crípticos dominan el plasmidoma de [31].

El intercambio y la dispersión genéticos pueden dejar una firma de similitud genética dentro de una población, que puede detectarse mediante análisis de redes [32,33,34,35,36]. Hasta ahora, las redes de similitud genética de plásmidos se han utilizado principalmente para analizar estructuras poblacionales amplias entre tipos de plásmidos y clasificarlos en unidades taxonómicas [33, 34, 37]. Los análisis de redes han revelado el intercambio de genes en toda la geografía, el tipo de hábitat y, hasta cierto punto, la filogenia del huésped [34, 38, 39]. Varios estudios identificaron plásmidos que proporcionan un puente entre comunidades bacterianas que de otro modo estarían desconectadas [18, 40]. Por lo tanto, las redes de similitud genética de plásmidos pueden permitirnos utilizar firmas de eventos pasados ​​dentro de una población de plásmidos para ayudar a identificar vías potenciales para transmisión futura. Esta aplicación, que es fundamental en el contexto de la resistencia a los antimicrobianos, sigue sin explorarse.

Debido a que los plásmidos son agentes infecciosos, la teoría y la metodología de la ecología de las enfermedades pueden resultar beneficiosas para comprender la relación entre la estructura de la red y la dinámica de transmisión [41,42,43,44]. El uso de redes de similitud de plásmidos para comprender los mecanismos de propagación de genes equivale a utilizar redes de intercambio de parásitos como indicador de una posible transmisión de parásitos entre comunidades hospedantes de múltiples especies en la ecología de enfermedades [42, 45], o redes que describen contactos entre individuos. Básicamente, cualquier “red de transmisión” describe vías potenciales para la transmisión de patógenos, y existen múltiples formas de estimar estas vías [44]. En el caso de la transmisión de genes entre plásmidos, este enfoque requiere que la información genética del plásmido se recopile dentro del mismo sistema. Sin embargo, casi todos los estudios utilizaron secuencias de plásmidos procedentes de entornos diversos y geográficamente distantes porque fueron extraídas de bases de datos [33, 34, 37, 39, 40]. El uso de plásmidos de diferentes sistemas es inadecuado para determinar vías de intercambio o dispersión genética en escalas espaciales y temporales más finas; por ejemplo, entre y dentro de huéspedes animales. Un estudio utilizó redes de similitud de plásmidos construidas a partir de plásmidos de tipo F de granjas ganaderas (vacas, cerdos u ovejas) y agua [46]. Las redes y comunidades de plásmidos se estructuraron según su amplio nicho ecológico (granja versus agua), lo que demuestra los límites potenciales de la dispersión de plásmidos y el intercambio genético entre entornos [46]. Aunque los datos se recolectaron en un sistema natural, las muestras de animales se agruparon por sitio, lo que impidió la estimación de la propagación de plásmidos entre huéspedes individuales.

Aquí, aprovechamos un conjunto de datos del plasmidoma ruminal de vacas lecheras en una sola población. Nuestro objetivo es identificar firmas de intercambio genético entre plásmidos y vías potenciales para la transmisión de genes dentro y entre las vacas. Para abordar este objetivo, utilizamos un marco de red ecológico multicapa, que aprovecha explícitamente la variación en la estructura de la red a través de múltiples capas de datos [47]. Capturamos firmas de similitud genética dentro y entre vacas individuales (ponedoras). Al adoptar enfoques analíticos y terminología de la ecología de las enfermedades, interpretamos los datos a la luz de la transmisión genética. Específicamente, buscamos firmas de superpropagación tanto a nivel de plásmidos como de vacas, donde unos pocos plásmidos (o vacas) son responsables de la mayor parte de la transmisión [48].

Encontramos que las redes de similitud genética de plásmidos están dominadas por vínculos entre vacas hospedadoras. La red de transmisión está muy fragmentada en grupos de plásmidos (es decir, módulos) con una distribución de tamaño muy heterogénea, lo que apunta al papel dominante de la transmisión entre huéspedes en la configuración de la firma genética de esta población de plásmidos. Esta heterogeneidad también indica una posible superpropagación tanto a nivel de plásmidos como de vacas. Además, descubrimos que los plásmidos con los mismos genes AMR, aunque poco comunes en nuestro conjunto de datos, formaban grupos (módulos) de redes independientes.

Los modelos mostraron que la estructura de la red determinaba el alcance de la transmisión genética. Al investigar las firmas de similitud genética en la red, podemos comprender cómo interactúan los plásmidos dentro y entre los huéspedes animales, lo que proporciona información sobre los mecanismos mediante los cuales los genes AMR pueden propagarse.

Construimos una red multicapa ponderada entre plásmidos. En nuestra red multicapa, cada vaca es una capa y los nodos dentro de cada capa son plásmidos (Fig. 1). Los enlaces intracapa se calcularon como la similitud genética entre plásmidos dentro de una capa en función de alineamientos de secuencias (Métodos). Una característica destacada de las redes multicapa son los enlaces entre capas, que conectan nodos entre capas y codifican procesos ecológicos que operan entre las capas [47]. Definimos los enlaces entre capas utilizando la misma medida que los enlaces intracapa (Fig. 1), lo que nos permite detectar simultáneamente firmas de intercambio de genes dentro y entre las vacas. Usar la misma definición también es ventajoso porque coloca los procesos intra y entre capas en la misma escala, evitando sesgos a priori de las métricas de la red hacia procesos que operan en cualquier tipo de borde [36, 47, 49].

Las vacas son ponedoras y los nodos físicos son plásmidos. El mismo plásmido puede aparecer en diferentes vacas (p. ej., el plásmido verde). Los enlaces intracapa (negro) y entre capas (azul) se ponderan y definen en función de la similitud de secuencia (ver Métodos). El gráfico circular muestra que la red está dominada por bordes entre capas.

Nuestra red incluyó 1344 plásmidos en 21 vacas. De estos plásmidos, el 92% se detectaron en una sola vaca. Debido a que los plásmidos pueden ocurrir en más de una vaca, el número total de nodos en la red excede el número de plásmidos. Siguiendo la terminología estándar [47, 50], definimos los plásmidos como "nodos físicos" y las combinaciones de plásmido-capa como "nodos de estado", lo que indica que el mismo plásmido puede estar en un estado ecológico diferente; por ejemplo, contribuir de manera diferente al intercambio de genes en diferentes vacas. Nuestra red incluía 1514 nodos estatales. El número máximo de vacas en las que se detectó un plásmido individual fue 13. El número de plásmidos por vaca osciló entre 1 y 175, con una media de 72. Si bien los pares de plásmidos (es decir, enlaces de red) podrían tener múltiples alineamientos entre ellos, 2728 de los 2738 enlaces contenían una sola alineación. En general, la red era muy escasa, con sólo el 0,2% de los enlaces potenciales realizados.

Preguntamos si los vínculos se daban principalmente dentro de las vacas o entre ellas para evaluar la importancia de las interacciones de los plásmidos entre los huéspedes. La mayoría de los bordes de la red estaban entre capas (Fig. 1). Sin embargo, una comparación de los recuentos de bordes sin procesar está sesgada por el número muy diferente de posibles bordes intra e intercapa (87 002 frente a 1 058 339, respectivamente). Por lo tanto, también comparamos la proporción de enlaces realizados dentro y entre capas de todos los posibles (es decir, densidad). La densidad de los bordes entre capas fue dos veces mayor que la de los bordes entre capas (0,25% frente a 0,12%). Por lo tanto, existe una firma de intercambio genético mucho más fuerte entre las vacas que dentro de ellas.

Probamos el efecto de la identidad de las vacas en la conectividad comparando la red observada con 1000 redes aleatorias en las que mezclamos la identidad de las vacas (en adelante, "redes mezcladas"). La red observada tenía una densidad significativamente mayor de bordes intra (p <0,001) e intercapas (p <0,001), y una densidad más alta (p <0,001) que las redes barajadas (Figura 1 complementaria). Esto indica que a pesar de la naturaleza dispersa de la red, todavía está más conectada y con una mayor contribución de bordes entre capas en comparación con los bordes intracapa de lo esperado de forma aleatoria. En general, la red estuvo dominada por la conectividad entre capas, lo que sugiere que el intercambio de genes es más probable entre plásmidos de diferentes vacas que dentro de una misma vaca.

Podemos utilizar la conectividad intra e intercapa para probar si plásmidos específicos contribuyen de manera desproporcionada a la transmisión e intercambio de genes examinando la distribución de su grado (número de plásmidos a los que está conectado un plásmido) y la distribución de enlaces con las vacas. Ambas distribuciones estaban muy sesgadas (asimetría = 10,5 y 10,4, respectivamente) (Figura complementaria 2), y la mayoría de los plásmidos tenían algunos enlaces y algunos plásmidos tenían muchos enlaces tanto con otros plásmidos como con vacas. Una distribución sesgada indica que pocos plásmidos pueden ser responsables de la mayor parte de la transmisión y las interacciones en la red. Este patrón está en línea con la teoría de superdifusión de la ecología de las enfermedades que consistentemente encuentra que unos pocos huéspedes (en este caso, plásmidos) son responsables de la mayor parte de la transmisión del parásito (en este caso, un gen AMR) [48, 51] (Información complementaria).

Aunque la red de similitud de plásmidos es muy escasa, aún puede contener vías importantes de intercambio de genes. En epidemiología y ecología de enfermedades, las áreas de posible transmisión en redes se pueden detectar utilizando algoritmos de detección comunitaria, denominados en términos generales modularidad [41, 52]. La modularidad es una propiedad de mesoescala en la que partes de la red son más densas en comparación con otras [53]. Detectamos módulos utilizando Infomap, un algoritmo basado en el movimiento de un caminante aleatorio en la red. Infomap está diseñado explícitamente para redes multicapa y también mide la cantidad de flujo contenido dentro de cada nodo (el flujo total a través de los nodos estatales en la red suma 1) [54,55,56]. La medición del flujo es particularmente adecuada para nuestros propósitos porque está directamente relacionada con la idea de intercambio de genes [56]. Por lo tanto, los módulos representan vías potenciales de transmisión de alto nivel.

Si bien la red estaba muy fragmentada con 414 módulos, lo estaba significativamente menos que las redes barajadas, que tenían, en promedio, un 83% más de módulos (723–797, media = 760, p <0,001) (Figura complementaria 3A). Al igual que con el patrón a nivel de nodo, esta topología de mesoescala estaba muy sesgada: mientras que la mayoría de los módulos en la red observada eran pequeños, con un promedio de 3,3 plásmidos en 3,4 vacas, un módulo excepcionalmente grande abarcaba 12 plásmidos y 16 vacas (≈4 veces el número promedio de plásmidos y vacas en un módulo). Este módulo incluía 215 enlaces, lo que representa el 7,9% de todos los enlaces de la red, la mayoría de los cuales eran intercapas (n = 205) e intramodulares (n = 206). Por lo tanto, representa una vía potencial importante de transmisión e intercambio genético entre plásmidos, particularmente entre diferentes huéspedes (Fig. 2A). Los nodos dentro de este módulo más grande abarcaron el 8% del flujo, que es un orden de magnitud mayor que el flujo medio por módulo (0,2%) (puntuación Z = 13,3, p < 10-5). La comparación con el módulo más grande en cada red barajada mostró que, si bien el número de plásmidos únicos (nodos físicos) dentro de un módulo no difirió (p = 0,35), el flujo en el módulo más grande de la red observada fue significativamente mayor que su contraparte más grande. módulos en las redes barajadas (p = 0,003) (Figura complementaria 3B). Por lo tanto, dentro de este gran módulo se produce más intercambio genético de lo esperado si los plásmidos se distribuyeran aleatoriamente entre las vacas. En conjunto, estos resultados apuntan a una parte de la red donde se produjo una cantidad desproporcionadamente grande de intercambio de genes.

Representación en perspectiva de capa AA de toda la red. Los nodos son vacas, su tamaño es proporcional al número de bordes intracapa dentro de cada vaca. Las etiquetas de los nodos indican el ID de la vaca y, entre paréntesis, la resistencia relativa calculada como el número de bordes entre capas que tiene una vaca dividido por el número total de bordes entre capas en la red. Un borde indica que al menos un borde de capa intermedia conecta dos vacas, y su ancho es proporcional al número total de bordes de capa intermedia entre vacas. Los nodos en rojo, rosa o ambos indican vacas que aparecen en el módulo más grande, el módulo de beta-lactamasa o en ambos, respectivamente. B Gráfico de barras del número de módulos por vaca. El número de módulos por vaca osciló entre 1 y 164, con una mediana de 63. C El porcentaje de módulos compartidos entre vacas. Cada celda se calcula como el número de módulos que la vaca j (columnas) comparte con i (filas), dividido por el número total de módulos que tiene j. Esta medida da como resultado una matriz asimétrica porque la proporción se calcula con respecto a una de las vacas del par y las vacas tienen diferente número de módulos. Las barras en B corresponden a las columnas de la matriz en C y están ordenadas por el número de módulos por vaca, de menor (izquierda) a mayor (derecha). Los rectángulos cian son ejemplos de dos vacas que comparten una alta proporción de módulos. Estas dos vacas también forman parte del módulo más grande y de beta-lactamasas (borde cian en A). Por lo tanto, pueden ser superpropagadores de genes AMR.

El número de módulos en los que estaban presentes las vacas estaba sesgado (Fig. 2B), pero indicó que las vacas comparten vías de transmisión. Para investigar más a fondo la posible transmisión entre vacas, calculamos el módulo compartido \(s_{ij} = \left| {m_i \cap m_j} \right|/m_j\). Es decir, el número de módulos compartidos entre pares de vacas (mi, mj), del total de módulos en vaca mj. El intercambio de módulos fue altamente asimétrico, oscilando entre 0 y 100% (mediana = 14%) (Fig. 2C). Como era de esperar, las vacas con pocos módulos compartían todos o la mayoría de ellos. Hubo una correlación negativa entre el número de módulos que albergaba una vaca y la proporción media de módulos compartidos con otras vacas (tau de Kendall = −0,785, p = 7,2e−7). Por lo tanto, unas pocas vacas pueden servir como centros para muchos grupos de plásmidos que interactúan, vinculando a las vacas periféricas con las vías de transmisión. Sin embargo, algunas vacas con muchos módulos todavía compartían una alta proporción de ellos. Por ejemplo, cuatro de las cinco vacas con el mayor número de módulos (125–164 módulos) compartieron entre el 53% y el 69% de sus módulos con otras vacas. Por tanto, existen posibles puntos críticos para la transmisión de plásmidos.

La proporción de módulos compartidos entre vacas fue mayor que el porcentaje de plásmidos compartidos, que osciló entre 0 y 66,6% con una mediana de sólo 0,71% (Figura complementaria 4). Casi la mitad (47,1%) de las parejas de vacas no compartían plásmidos. Si bien este patrón es parcialmente un artefacto del número mucho mayor de plásmidos en comparación con los módulos, también demuestra que si bien las vacas predominantemente no albergan plásmidos idénticos, aún comparten vías de transmisión. Esta observación fue respaldada aún más por la baja correlación entre la proporción de módulos compartidos y la proporción de plásmidos compartidos (tau de Kendall = 0,41, p <2,2e-16).

Para validar la noción de las vacas como centros de transmisión, comparamos el intercambio de módulos observado con el obtenido en las redes barajadas. Para cada par de vacas, calculamos una puntuación z de intercambio de módulos (Métodos). De los 420 pares posibles, 98 compartieron significativamente más (puntuación z > 1,96) y 194 compartieron significativamente menos módulos (puntuación z < −1,96) que la expectativa aleatoria. El sesgo hacia un menor número de pares de vacas que comparten muchos módulos es nuevamente consistente con una posible superdifusión en la red, esta vez a nivel de vaca. En conjunto, estos resultados ilustran que las firmas de posible superpropagación se observan no sólo a nivel de plásmido sino también a nivel de vaca.

Luego preguntamos cómo la estructura de la red podría afectar la propagación de un gen hipotético transmitido por un plásmido AMR a través de la población de vacas. Para abordar esto, construimos un modelo estocástico de transmisión genética basado en agentes. En este modelo, el gen está presente inicialmente en un único plásmido (nodo de estado). Elegimos al azar 20 plásmidos iniciales: 10 plásmidos altamente conectados que forman parte del módulo más grande y 10 plásmidos periféricos de los módulos más pequeños (aquellos que contienen dos nodos de estado). En cada paso de tiempo, un cierto número de pares de plásmidos entran en contacto. Si uno de los plásmidos del par tiene el gen, la probabilidad de que el gen se transmita al segundo plásmido es igual a la similitud genética (peso de borde) entre ellos, ya que las investigaciones han demostrado que el pHGT se correlaciona positivamente con la similitud genética [57 ]. Las bacterias están implícitas en nuestro modelo y suponemos que el contacto de los plásmidos se produce dentro de las células bacterianas. El gen también puede perderse de un plásmido con una tasa que depende del nivel de presión de selección positiva (una presión de selección más alta conduce a tasas de pérdida más bajas). Para determinar las compensaciones entre el contacto de plásmidos y la presión de selección, ejecutamos el modelo con tasas de contacto totales bajas (10 plásmidos en contacto), intermedias (100 plásmidos en contacto) y altas (1000 plásmidos en contacto) y tomamos en cuenta la presión de selección. a través de tasas de pérdida de genes: alta (0 pérdida per cápita), intermedia (0,01 per cápita) y baja (0,1 per cápita). Ejecutamos el modelo durante 1000 pasos de tiempo y medimos el número de vacas a las que llegó el gen AMR.

A altas tasas de contacto, el gen se dispersó rápidamente a todas las vacas en aproximadamente la misma cantidad de tiempo en cualquier nivel de presión de selección (Fig. 3). En un contacto intermedio, el gen podría llegar a todas las vacas con una presión de selección alta o intermedia. Sin embargo, tomó, en promedio, aproximadamente nueve veces más pasos de tiempo en comparación con las simulaciones de alta presión de selección. Con un contacto bajo, solo fue posible que el gen llegara a todas las vacas con una presión de selección alta, pero esto solo ocurrió en un pequeño porcentaje de las simulaciones (14-15%) y cuando lo hizo, requirió ~900 pasos de tiempo en promedio ( Fig. 3, Tabla complementaria 1).

Resultados de simulaciones de transmisión genética entre vacas cuando el gen se origina en un plásmido altamente conectado. Cada punto es el número de vacas con el gen en cada paso de tiempo promediado en 300 simulaciones por plásmido. El contacto se refiere a la tasa de contacto entre plásmidos. Cuando los plásmidos se encuentran entre sí y, en consecuencia, intercambian genes a un ritmo elevado, el gen se transmite rápidamente a toda la población de vacas. Consulte la Fig. 5 complementaria para obtener resultados de simulaciones que comienzan con plásmidos periféricos.

Los patrones de transmisión de genes fueron casi idénticos cuando comenzaron en plásmidos altamente conectados o periféricos (Fig. 3, Fig. 5 complementaria, Tabla 1 complementaria). Una dinámica similar entre plásmidos periféricos o altamente conectados puede deberse al hecho de que una vez que un plásmido llega a una vaca bien conectada, se propaga extremadamente rápidamente a otras (Fig. 2). Por ejemplo, incluso las cinco vacas que no forman parte del módulo más grande todavía contenían otros módulos grandes (9 a 18 nodos estatales). Por lo tanto, incluso bajo una presión de selección baja o intermedia, la conectividad entre módulos de vacas puede permitir que los genes lleguen rápidamente a todos los huéspedes de esta población a través de pHGT si el contacto entre los plásmidos es lo suficientemente alto. Otro posible factor es el tamaño pequeño de la población de vacas (n = 21) estudiada aquí.

Hasta ahora, hemos demostrado que existen firmas no aleatorias de contribuciones desproporcionadas de plásmidos y vacas al intercambio genético. Sin embargo, estos patrones no sugieren mecanismos particulares mediante los cuales pueda ocurrir el intercambio de genes. Nuestra hipótesis es que dicha información está contenida en la distribución de los pesos de los enlaces. Específicamente, la dispersión de plásmidos debería manifestarse por una alta similitud entre los plásmidos (vínculos muy fuertes), ya que los dos nodos son esencialmente el mismo plásmido. Por el contrario, los pesos de enlace bajos indicarán pHGT porque se comparte una pequeña sección del ADN de los plásmidos (p. ej., mediante recombinación). La distribución de los pesos de los bordes en la red mostró dos rupturas abruptas en 0,5 y 0,95 (Fig. 4A, B). Presumimos que estas rupturas corresponden a pHGT (pesos de borde <0,5) y dispersión (pesos de borde> 0,95). Entre estos dos escenarios se encuentra un tercero, al que llamamos “dispersión distante”. En la dispersión a distancia, un plásmido se dispersa y luego sufre un cambio genético mediante mutación o reordenamientos mediante transposones. Si bien es imposible identificar el mecanismo particular del cambio genético mediante la similitud genética por pares en este escenario, tal mecanismo podría explicar por qué la dispersión distante se encuentra entre HGT y la dispersión.

AA visualización simplificada de cada subred multicapa (similar a la Fig. 2A). Los nodos son vacas y su tamaño es proporcional al número de bordes intracapa dentro de ellos. Los bordes indican bordes entre capas entre vacas y su ancho es proporcional al número total de bordes entre capas. B La distribución de los pesos de los bordes en la red tiene dos rupturas abruptas (líneas grises verticales) en 0,5 y 0,95. C Diagrama de Venn que muestra la cantidad de plásmidos compartidos entre las tres subredes. Los porcentajes se calculan con respecto al número total de plásmidos en el conjunto de datos. El tamaño del círculo es ilustrativo del número de plásmidos y bordes en la subred.

La división en subredes representa una hipótesis de que estos mecanismos (pHGT y dispersión) impulsan la distribución de peso de borde observada. El primer paso para abordar esta hipótesis es probar si esta distribución está determinada de forma no aleatoria por la similitud de secuencia, que es el patrón resultante del intercambio de genes. Volvimos a muestrear la longitud de alineación entre pares de plásmidos sin reemplazo 1000 veces, dejando todos los demás valores iguales. Luego volvimos a calcular los pesos de los bordes en el conjunto de datos remuestreado. Las dos rupturas abruptas no existieron en las redes remuestreadas. Además, la distribución del peso de los bordes observada fue significativamente diferente de la obtenida mediante el remuestreo (prueba de Kolmogorov-Smirnov, D = 0,25, p <0,0001), lo que indica que la distribución observada es probablemente el resultado de procesos biológicos (Figura complementaria 6).

Luego investigamos cada mecanismo de intercambio de genes dividiendo la red en tres subredes multicapa de acuerdo con los pesos de los enlaces (Fig. 4A, B). Las subredes variaron en tamaño, con la subred de dispersión distante dominando en número de plásmidos y bordes (Fig. 4C). Si bien los bordes solo pueden pertenecer a una subred, los plásmidos pueden pertenecer a múltiples subredes (Fig. 4C). La subred pHGT tuvo la mayor densidad de bordes intra (0,50 %) e intercapas (0,78 %) en comparación con la dispersión reciente (intracapa = 0,38 %; intercapa = 0,22 %) y la dispersión distante (intracapa = 0,38 %; intercapa = 0,22 %). capa = 0,11%; capa intermedia = 0,25%) subredes. Estas diferencias en densidad apuntan a la importancia de pHGT en la conducción de patrones de similitud genética observados en la red.

Luego preguntamos si los rasgos funcionales del plásmido influyen en la importancia del plásmido y la estructura modular. Para ello, examinamos el papel de los genes de movilidad de plásmidos, que proporcionan la capacidad de transferirse a nuevos huéspedes bacterianos (Métodos). Los plásmidos que son conjugativos (o autotransmisibles) codifican todas las proteínas necesarias para transferirse, mientras que los que son movilizables deben utilizar la maquinaria, particularmente el complejo de formación de pares de apareamiento, de otro elemento en la célula para la transferencia [58,59,60 ]. Generalmente, al menos la mitad de los plásmidos no son movilizables (ni conjugativos ni movilizables) [58]. Medimos el efecto de los genes mob sobre el grado de los plásmidos, el flujo de módulos y las características de los módulos en los que se encuentran mediante pruebas de Mann-Whitney-Wilcoxon. En el conjunto de datos, 235 plásmidos (17,4%) tenían genes mob. Encontramos que los plásmidos con genes mob tenían un grado significativamente mayor y un mayor flujo, pero no se encontraron en una mayor cantidad de vacas, en comparación con los plásmidos sin genes mob. Los módulos que contenían plásmidos con genes mob (83 de 414) eran más grandes, contenían plásmidos más únicos, abarcaban más vacas y tenían un mayor flujo (Tabla 1).

Los 12 plásmidos del módulo más grande (Fig. 2A) contenían un gen mobM, que se sabe que está ampliamente distribuido entre los plásmidos aislados de enterococos, estreptococos y estafilococos. Los dos primeros prevalecen en el entorno del rumen y están formados por representantes conocidos como Streptococcus bovis y Enterococcus faecalis [61], lo que podría explicar la presencia de plásmidos dentro de este módulo. Es probable que un plásmido con un gen de movilidad tenga altas tasas de dispersión entre huéspedes bacterianos de estos linajes y, por tanto, entre vacas. Por lo tanto, este módulo podría estar compuesto por plásmidos que se recombinan con los genomas de sus huéspedes bacterianos y entre ellos mismos a medida que ocurren en los mismos huéspedes. Es importante señalar que las interacciones plásmido-plásmido podrían estar mediadas a través del genoma bacteriano. Por lo tanto, no es necesario que los plásmidos coincidan temporalmente dentro de la misma célula para recombinarse. Una hipótesis alternativa es que estos plásmidos pertenecen a un ancestro plásmido común cuyas múltiples copias sufrieron cambios genéticos mientras se movilizaban entre huéspedes. Apoya esta hipótesis el hecho de que el 95% de los bordes del módulo eran bordes de dispersión. Sin embargo, estos dos escenarios de recombinación de plásmidos y modificación de ancestros de plásmidos no son mutuamente excluyentes.

Identificamos ORF relacionados con la resistencia a los antimicrobianos en 12 plásmidos (0,9%). Ocho fueron para betalactámicos, tres para resistencia a tetraciclina y uno para proteína fijadora de penicilina. Curiosamente, los plásmidos con resistencia a betalactámicos y tetraciclinas se separaron en dos módulos distintos que no contenían otros plásmidos. El módulo que contenía los plásmidos resistentes a betalactámicos abarcaba 11 vacas diferentes, lo que lo convierte en el tercero más grande de la red en términos de capas (Fig. 2A). De los bordes que vinculan los plásmidos con la resistencia a los betalactámicos, el 77% pertenecía a la subred de dispersión distante, mientras que el resto pertenecía a la subred de dispersión reciente. Todos los enlaces entre los tres plásmidos con resistencia a la tetraciclina correspondieron a la red de dispersión distante. Por lo tanto, la dispersión de plásmidos es probablemente el mecanismo principal para la propagación de la resistencia a los antibióticos mediada por plásmidos entre huéspedes. Esto sugiere que la presión selectiva sobre los genes de resistencia a los antibióticos podría promover la dispersión y persistencia de estos plásmidos entre las vacas.

Una brecha importante en la comprensión de la propagación de la RAM implica comprender cómo los genes de la RAM transmitidos por plásmidos se propagan dentro y entre las comunidades microbianas y los huéspedes animales. Abordamos esta brecha aprovechando la teoría y los métodos de la ecología microbiana y de enfermedades, utilizando redes multicapa de similitud genética entre plásmidos en una población de vacas lecheras. Si bien las redes de similitud genética de plásmidos se han utilizado anteriormente para clasificar plásmidos [33, 34, 37] e identificar la transmisión de genes transmitidos por plásmidos entre entornos y geografías a escalas evolutivas [18, 38, 39], estas escalas son menos relevantes para la transmisión. dentro de las poblaciones animales. Aquí utilizamos la firma dejada por el intercambio genético entre plásmidos en sus patrones de similitud de secuencia para comprender la transmisión de plásmidos entre huéspedes a una escala relevante para la transmisión de la resistencia antimicrobiana mediada por plásmidos.

Específicamente, encontramos evidencia de superpropagación, incluidas distribuciones altamente sesgadas para el grado de nodo a nivel de plásmido y el intercambio de módulos a nivel de vacas. Además, demostramos que el módulo que contiene plásmidos con un gen mobM y el módulo de plásmidos con un gen de resistencia a betalactámicos coinciden en ocho de las 21 vacas. Estas vacas podrían ser súper propagadoras de la resistencia a los betalactámicos porque su propagación del módulo de betalactámicos al módulo más grande podría provocar una rápida transmisión del gen entre la población de vacas. Se ha encontrado superpropagación en la propagación de la resistencia a los antimicrobianos tanto en humanos [62,63,64] como en vacas [65]. Las redes sociales de las vacas también han demostrado que la mayoría de los individuos tienen relativamente pocos vínculos con otros, mientras que algunos individuos están muy conectados, lo que indica aún más el potencial de superpropagación en caso de un brote [66].

Identificar patrones de superpropagación es importante porque pueden guiar las estrategias de gestión y control para prevenir la propagación de patógenos o la resistencia a los antimicrobianos y aumentar la eficacia de las intervenciones dirigidas a los individuos o grupos más conectados de la red [51, 65, 67 ]. El modelo de transmisión que presentamos es un enfoque novedoso en esta dirección porque vincula la estructura de las redes de similitud de plásmidos con la transmisión de genes. Si bien las redes de similitud de plásmidos se usan típicamente para discernir procesos que generaron estructuras observadas, nuestro modelo se puede usar para probar múltiples hipótesis sobre el efecto de la estructura de la red en la posible transmisión de genes.

La presencia de genes mob afectó la conectividad de los plásmidos y la estructura de la red. Estudios anteriores también encontraron que los plásmidos conjugativos y movilizables están más conectados que los no movilizables [39, 68]. Los plásmidos con genes mob pueden tener un mayor grado de nodo porque pueden dispersarse más rápidamente entre bacterias y encontrarse con otros plásmidos con mayor frecuencia, especialmente porque es más probable que los plásmidos movilizables o conjugativos se encuentren en diferentes familias bacterianas. Esto fue especialmente evidente en los plásmidos del módulo más grande. Por el contrario, es más probable que los plásmidos no movilizables estén restringidos a una sola especie [34]. Sin embargo, también es importante considerar que muchos plásmidos pequeños aún pueden propagarse rápidamente en poblaciones bacterianas, aunque actualmente los mecanismos no se comprenden bien [68].

El análisis de la modularidad en nuestra red nos permitió identificar posibles vías de transmisión entre hosts. Los huéspedes con plásmidos similares tienen más probabilidades de compartir genes de RAM, como se ha demostrado para los tipos de patógenos [42]. El hecho de que todos los plásmidos con resistencia a betalactámicos y tetraciclinas se encontraran en módulos distintos respalda la idea de que los módulos representan posibles vías de transmisión de genes. Esta conclusión se ve reforzada por nuestra observación de que la movilidad del plásmido afectó fuertemente la estructura modular. La presencia de varios módulos grandes que abarcan una gran proporción de los ecosistemas del rumen de las vacas en esta población sugiere que tanto los plásmidos como los genes que portan pueden dispersarse rápidamente a través de esta población huésped. El modelo dinámico apoyó este resultado. Debido a que la conectividad de los módulos entre vacas es alta, incluso si un gen aparece en una vaca periférica, rápidamente se dispersará a otras.

La red estaba dominada por bordes entre capas, que unían plásmidos en diferentes vacas. Nuestra hipótesis es que la conectividad entre capas está mediada principalmente por la transferencia bacteriana entre vacas, mientras que la conectividad intracapa está mediada por la conjugación de plásmidos dentro del rumen de cada vaca individual. La investigación sobre la resistencia a los antimicrobianos mediada por plásmidos en el sector sanitario demostró que los plásmidos a menudo se transfieren entre individuos a través de una única cepa bacteriana. Al mismo tiempo, tienden a transferirse entre especies dentro del microbioma intestinal de los individuos [62]. Por lo tanto, nuestros resultados podrían indicar que estos plásmidos se transfieren entre vacas transportadas por colonizadores microbianos particularmente eficientes. Sin embargo, también se ha demostrado que los plásmidos se dispersan entre huéspedes humanos independientemente de la transmisión de bacterias [69]. Nuestros datos de plasmidoma no incluyen los huéspedes bacterianos involucrados (ver más abajo). Por lo tanto, si bien no podemos probar esta hipótesis, estudios futuros en esta dirección pueden arrojar luz sobre la importancia relativa de los procesos HGT y pHGT multinivel (movimiento de bacterias o movimiento de plásmidos).

Utilizamos las redes de similitud para discernir las funciones de HGT y dispersión, las cuales desempeñan un papel importante en la propagación de la resistencia a los antimicrobianos [62, 69]. Nuestra exploración inicial de estas nuevas hipótesis mostró que la distribución del peso de los bordes claramente segmentados no era aleatoria y, por lo tanto, probablemente estaba impulsada por procesos biológicos. Sin embargo, la división entre pHGT, dispersión reciente y red de dispersión distante sigue siendo una hipótesis. Se necesita más investigación, tanto a través de modelos como de experimentos, para probar esta hipótesis observando las tasas de pHGT y mutación en poblaciones de plásmidos y determinando bajo qué condiciones se puede reproducir la distribución del peso del borde.

Nuestros resultados muestran claramente una amplia dispersión de plásmidos entre vacas, pero no tenemos información sobre el mecanismo de dispersión. En entornos sanitarios, los plásmidos se transfieren entre pacientes a través de trabajadores sanitarios o reservorios ambientales [62, 69,70,71]. En las vacas, los plásmidos podrían transferirse a través de la saliva durante el aseo, especialmente si los plásmidos del rumen se regurgitaban durante la rumia o se encontraban en la boca de otro modo. Alternativamente, la transmisión puede ocurrir por vía fecal-oral, ya que las vacas pueden frotar, oler o lamer el área genital de otros individuos [66]. La transmisión también podría ser posible a través de bioaerosoles de las heces [72]. Combinar nuestras redes de similitud de plásmidos con redes sociales, utilizando medidas como proximidad, alojamiento compartido o uso de espacio compartido entre vacas [43, 66, 73] podría proporcionar más información sobre cómo se transmiten los plásmidos entre individuos.

Nuestro estudio tiene varias limitaciones. En primer lugar, no hemos considerado explícitamente las bacterias hospedadoras de los plásmidos. En segundo lugar, no tenemos ninguna medida del contacto social de las vacas. En tercer lugar, nuestros datos representan sólo una instantánea en el tiempo; El análisis longitudinal de series de tiempo podría proporcionar más información sobre la dinámica de las interacciones y la dispersión de los plásmidos [74]. En cuarto lugar, nuestro método para calcular la similitud de los plásmidos se basa en alineamientos, que podrían no considerar reordenamientos en los genomas de los plásmidos [33]. Por último, sólo consideramos plásmidos circulares, aunque los plásmidos lineales también pueden portar genes AMR (ver también Métodos) [75]. A pesar de estas limitaciones, nuestro estudio proporciona la primera idea del posible intercambio de genes a través de plásmidos con una resolución espacio-temporal relevante.

En conclusión, las redes de similitud genética proporcionan una herramienta poderosa para comprender el potencial de transmisión de los plásmidos y sus genes dentro de las poblaciones de huéspedes. Demostramos que los plásmidos se transmiten ampliamente entre individuos dentro de una población de vacas lecheras, con firmas de superpropagación tanto a nivel de plásmidos como de vacas. Las funciones de los plásmidos, particularmente la RAM y la movilidad, influyen en la estructura de la red. La similitud genética entre los plásmidos en esta población de vacas muestra firmas tanto de dispersión como de intercambio genético, lo que proporciona información sobre cómo la RAM mediada por plásmidos puede propagarse entre los huéspedes.

Utilizamos un conjunto de datos existente de plásmidos secuenciados del rumen de 22 vacas lecheras Holstein israelíes alojadas en la misma granja [30]. Esta configuración experimental incluye una dieta de cría típica y estándar aplicada en múltiples granjas en todo el mundo para regímenes de agricultura intensiva. Esto nos permitió tener condiciones consistentes sin factores de confusión conocidos. Las vacas del estudio no fueron tratadas con antibióticos, ya que dañan el microbioma del rumen del que dependen. Por lo tanto, la expectativa general de identificar genes de RAM no era alta a priori.

Los protocolos de muestreo y bioinformáticos se describieron previamente [30]. En resumen, se obtuvieron muestras de líquido ruminal de cada vaca, se extrajo el ADN, se amplificó utilizando la polimerasa phi29 y se secuenció utilizando el protocolo de extremos emparejados (secuenciador GAIIX y HiSeq [Illumina]) [30]. Las lecturas de cada vaca se ensamblaron primero en contigs de plásmidos utilizando SPAdes [76]. Nos centramos en los plásmidos como elementos móviles y eliminamos el ADN cromosómico que podría sesgar nuestros análisis. Por lo tanto, utilizamos la herramienta de reciclaje [77] para seleccionar solo plásmidos circulares de los contigs para identificar secuencias circulares cerradas que no son cromosomas bacterianos. Sin embargo, incluso con este enfoque estricto, el método aún identificó plásmidos de entre 2000 y 7297 pb y que portan genes AMR.

El conjunto completo de datos de plásmidos contenía 8741 secuencias de plásmidos. A cada secuencia se le asignó un nombre según la vaca en la que se detectó. Comparamos secuencias de plásmidos por pares utilizando el algoritmo BLASTn [30]. Detectamos secuencias de plásmidos idénticas secuenciadas de diferentes vacas en el conjunto de datos comparando la longitud del plásmido, la longitud de alineación y el porcentaje de identidad. Los plásmidos idénticos fueron aquellos con la misma longitud y 100% de identidad en más del 100% de su longitud sin espacios en la alineación. Luego confirmamos que estos plásmidos eran idénticos alineándolos en el software Geneious (v.11). Se identificaron un total de 314 secuencias como idénticas a al menos otra secuencia en el conjunto de datos y, en consecuencia, se agruparon en 138 plásmidos idénticos. Cada plásmido idéntico se ensambló de 2 a 5 vacas, dejando 8565 plásmidos únicos. No realizamos ninguna agrupación adicional. A cada plásmido único se le asignó un número de identificación de nodo (1–8565). A los plásmidos idénticos se les asignó la misma identificación de nodo. A cada vaca también se le asignó una identificación de capa única (1–22). La vaca número 2 no contenía plásmidos que cumplieran con nuestros criterios y fue excluida.

Debido a que los contigs se ensamblaron a partir de muestras individualmente, asignamos las lecturas de cada vaca individual al conjunto completo de contigs de plásmidos usando bbmap con el parámetro "ambig" establecido en "todos" para determinar si se detectaron plásmidos adicionales del conjunto de datos en el El conjunto original estaba presente en vacas individuales. Basándonos en el mapeo de lectura, medimos la cobertura de cada secuencia de plásmido en cada vaca. Consideramos que los plásmidos estaban presentes en una vaca si tenían una cobertura del 100% en esa vaca.

Utilizamos anotaciones publicadas previamente para los ORF de plásmidos [30]. Estos ORF se anotaron comparándolos con la base de datos de proteínas NCBI-NR utilizando un valor de corte máximo de E de 10-5. Para cada ORF, se eligió el resultado con el valor de E más bajo, a menos que fuera una proteína hipotética, en cuyo caso elegimos el siguiente valor de E más bajo. Si los cinco valores de E más bajos fueron proteínas hipotéticas, el ORF se anotó como hipotético. Luego, las funciones anotadas se seleccionaron manualmente en categorías funcionales como "plásmido", "fago" y "metabolismo del azúcar" según su descripción en la base de datos.

Realizamos análisis bioinformáticos adicionales en todos los plásmidos en el conjunto de datos utilizando el Identificador de gen de resistencia (https://github.com/arpcard/rgi). No detectamos genes AMR adicionales, pero los que ya estaban en nuestro conjunto de datos fueron verificados nuevamente, corroborando nuestros análisis anteriores [30]. Además, para todos los plásmidos en el conjunto de datos, predijimos los ORF usando Prokka y utilizamos KofamScan para identificar ortologías KEGG, lo que resultó en 15 KO en 40 plásmidos. Destruimos específicamente los plásmidos en el módulo n.° 1 (el módulo más grande). Debido a que los resultados de la explosión de plásmidos completos no tuvieron resultados, también buscamos manualmente dominios conservados de los plásmidos en el módulo n.° 1 y el módulo n.° 2 (que contenían los plásmidos con los plásmidos portadores de betalactámicos) utilizando la herramienta Dominio conservado con NCBI ( https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi?RID=3FEF4TF8013&mode=all). Estos resultados se pueden encontrar en la Información complementaria.

Utilizamos redes no dirigidas porque la direccionalidad del intercambio o divergencia entre plásmidos no puede obtenerse únicamente a partir de la similitud de secuencia [37, 78]. Para cada par de plásmidos, calculamos un peso de borde como:

donde i y j son plásmidos alineados, ls es la longitud de la alineación, li y lj son las longitudes totales de los plásmidos i y j, k es el número de alineaciones entre los plásmidos y pi es el porcentaje de identidad entre los plásmidos para un alineación dada. Si bien la longitud del plásmido en el conjunto de datos osciló entre 2000 y 7297 pb (media = 2751 pb), los plásmidos alineados generalmente tenían una longitud similar, con un 72 % entre 2000 y 3000 pb).

Antes de construir nuestras redes, realizamos un análisis de sensibilidad para determinar el límite de longitud del plásmido que se incluirá en nuestro análisis. Comparamos el número de plásmidos y alineamientos (total, intracapa e intercapa) retenidos en los datos en umbrales de longitud del plásmido (500–3000 pb en incrementos de 500 pb) y longitud de alineación (20% del plásmido más corto en un par determinado). y el 20% del umbral). Si bien el número de bordes intracapa fue relativamente estable en todos los umbrales, encontramos que el número de bordes entre capas retenidos se estancó en un umbral de longitud de 2000 pb, mientras que prácticamente no hubo efecto de los dos umbrales de alineación. Con base en estos resultados, restringimos nuestros análisis a secuencias de plásmidos> = 2000 pb y alineaciones que cubrían> = 20% de la longitud del plásmido más corto en un par (Figura complementaria 7). El porcentaje mínimo de identidad para las alineaciones fue >=70% [30].

Calculamos el grado intra, inter y total de cada plásmido como el número de enlaces intracapa, enlaces entre capas y ambos, respectivamente. Probamos la asimetría en la distribución de la centralidad de grado y los enlaces de capa utilizando la función de asimetría en los momentos del paquete [79]. Calculamos la densidad de la red como la proporción entre el número total de bordes realizados (definido como al menos una alineación que abarca ≥20% de la longitud del plásmido más corto en un par), dividida por el número total de bordes potenciales. Calculamos el número de bordes potenciales dentro y entre capas, Pintra y Pinter, respectivamente, de la siguiente manera. Para bordes intracapa:

donde Nc es el número de plásmidos en la vaca c, y hay vacas C. Para bordes entre capas:

donde N es el número de nodos de estado (combinaciones de capa de plásmido) en la red: \(N = {\sum }_c^C N_c\).

Permutamos la identidad de las vacas en las que se encuentran los plásmidos, creando 1.000 redes barajadas. El algoritmo conservó la distribución de los pesos de los bordes en la red y el número y la identidad de los enlaces entre plásmidos únicos. Sin embargo, no limitó la cantidad de plásmidos en una vaca ni la cantidad de vacas en las que podría ocurrir un plásmido. Calculamos la densidad y la proporción de los bordes entre capas e intracapa de cada red barajada como se describió anteriormente para la red observada. Luego comparamos la densidad intra e intercapa y la relación de densidad inter:intra capa en la red observada con la distribución de valores para estas métricas en las redes barajadas. Para comparar el intercambio de módulos en redes observadas y aleatorias, calculamos las puntuaciones z como

Obtuvimos la partición de la red en módulos utilizando el algoritmo de mapa de información [54, 80] implementado en el paquete R de infomapecología [56]. En resumen, infomap minimiza una función llamada ecuación del mapa utilizando un algoritmo de Louvain modificado y extendido para dividir la red en módulos de una manera que minimice la cantidad de información necesaria para describir los movimientos de un caminante aleatorio a través de la red. Los módulos indican grupos de nodos en la red que están más conectados entre sí que con otros nodos. Infomap es una herramienta útil para analizar este tipo de red porque explica explícitamente la estructura de red multicapa y es computacionalmente eficiente [56]. Debido a que Infomap se basa en el flujo, es particularmente relevante para este estudio, cuyo objetivo es buscar firmas de flujo genético [56]. Para determinar si la modularidad y el flujo observados no eran aleatorios, aplicamos Infomap con los mismos parámetros que en la red observada en cada una de las redes barajadas (descritas anteriormente) y comparamos la distribución de la modularidad, las características del módulo, el flujo y las características de la red. módulos más grandes en las redes barajadas a la red observada.

Al comparar las medidas de una red observada con las obtenidas de redes barajadas, calculamos los valores de p como la proporción de redes barajadas con valores mayores o menores que el valor observado. Comparar las redes observadas con las barajadas de esta manera es una práctica común y bien establecida en la ecología de redes [81,82,83]. Calculamos todas las correlaciones y sus valores p usando la función cor.test en el paquete de estadísticas del programa R. Usamos la tau de Kendall para medir todas las correlaciones debido a la no normalidad de los datos y la presencia de valores atípicos. Ejecutamos pruebas de Mann-Whitney-Wilcoxon utilizando la función wilcox.test en el paquete de estadísticas del programa R con "emparejado" establecido en "falso".

Utilizamos el método directo de Gillespie [84] para obtener simulaciones estocásticas exactas para nuestro modelo de dispersión de genes. Consideramos dos eventos. En primer lugar, la copia del gen en cualquier nodo de estado (un plásmido en una capa determinada) podría perderse al azar. La pérdida de genes se determinó mediante una tasa de pérdida per cápita y, por lo tanto, para cada evento de pérdida, elegimos un gen para eliminarlo entre los nodos estatales que contienen el gen, con igual probabilidad. En segundo lugar, cualquier par de nodos estatales podría estar en contacto y propagar el gen de un nodo estatal a otro. Para simplificar, consideramos una tasa de contacto constante (contactos por unidad de tiempo) en todos los nodos estatales. Para cada evento de contacto, el algoritmo selecciona dos nodos de estado al azar. Si uno de los nodos de estado contiene el gen, puede transmitirse al otro nodo de estado con una probabilidad igual a la similitud entre ambos nodos de estado. Esto incorpora explícitamente la estructura de red en el modelo. Cada simulación del modelo corresponde a una única realización de este proceso estocástico. Para cada uno de los 20 plásmidos iniciales, ejecutamos el modelo durante 1000 pasos de tiempo sin unidades 300 veces para cada combinación única de tasa de contacto y pérdida.

Toda la gestión y análisis de datos se realizaron en R v.4.1.1 [85].

Todos los archivos de datos y scripts R utilizados para el análisis estadístico y la generación de cifras para este trabajo están disponibles en el repositorio de GitHub:

https://github.com/Ecological-Complexity-Lab/Plasmid_multilayer_networks

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Este trabajo fue apoyado por una subvención de investigación 1281/20 de la Fundación de Ciencias de Israel (ISF) para SP, DIP (2476/2-1) para IM, ISF (1947/19) para IM y ERC (866530) para IM. JTS contó con el apoyo de una beca postdoctoral del Programa de Liderazgo STEM de Zuckerman. VJO contó con el apoyo de una beca Margarita Salas financiada por el Ministerio de Universidades de España y la “Unión Europea - Next GenerationEU”.

Julia Teresa Shapiro

Dirección actual: Unidad de Apoyo a la Epidemiología y la Vigilancia, Universidad de Lyon, Agencia Francesa de Seguridad y Salud Alimentaria, Ambiental y Ocupacional (ANSES), Lyon, Francia

Departamento de Ciencias de la Vida, Universidad Ben-Gurion del Negev, Be'er Sheva, Israel

Julie Teresa Shapiro, Alvah Zorea, Vincent J. Ontiveros, Itzhak Mizrahi y Shai Philosopher

Instituto Nacional de Biotecnología en el Negev, Universidad Ben-Gurion del Negev, Be'er Sheva, Israel

Alvah Zorea & Itzhak Mizrahi

Programa de Genómica Matemática, Departamento de Biología de Sistemas, Centro Médico Irving de la Universidad de Columbia, Nueva York, NY, EE. UU.

Aya Brown Kav

Instituto de Ecología Acuática, Universidad de Girona, Girona, España

Vicente J. Ontiveros

Escuela Goldman Sonnenfeldt de Sostenibilidad y Cambio Climático, Universidad Ben-Gurion del Negev, Be'er Sheva, Israel

Filósofo Shai

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SP y JTS concibieron el estudio. JTS, AZ, AKB y VJO produjeron y analizaron los datos. SP supervisó la investigación. JTS, SP e IM adquirieron financiación. JTS y SP escribieron el artículo con aportaciones de los coautores. Todos los autores contribuyeron a la revisión y edición del artículo.

Correspondencia a Julie Teresa Shapiro o Shai Pilosof.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Shapiro, JT, Zorea, A., Kav, AB et al. Las redes multicapa de similitud genética de plásmidos revelan vías potenciales de transmisión de genes. ISME J 17, 649–659 (2023). https://doi.org/10.1038/s41396-023-01373-5

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Recibido: 31 de agosto de 2022

Revisado: 11 de enero de 2023

Aceptado: 16 de enero de 2023

Publicado: 09 de febrero de 2023

Fecha de emisión: mayo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41396-023-01373-5

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